蛋白質(zhì)的生產(chǎn)是學(xué)術(shù)界和工業(yè)界研究的重要組成部分，可以通過生物學(xué)方法或化學(xué)合成來完成。大多數(shù)蛋白質(zhì)是通過生物表達(dá)獲得的，該過程很大程度上限制了其化學(xué)組成到典型的蛋白原氨基酸上。遺傳密碼擴(kuò)展前進(jìn)已允許在天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中摻入多達(dá)兩個(gè)非天然氨基酸。相比之下，當(dāng)需要整合多個(gè)非天然氨基酸，翻譯后修飾或人工骨架時(shí)，化學(xué)合成可提供無與倫比的靈活性。合成蛋白已經(jīng)可以使用通過固相和結(jié)扎方法的結(jié)合。然而，蛋白質(zhì)的總體化學(xué)合成仍保持高度勞動(dòng)密集型。
【研究成果】
由于無效的偶聯(lián)和副反應(yīng)，長約50個(gè)氨基酸均質(zhì)肽的固相肽合成一直是長期的挑戰(zhàn)。近日，Science雜志刊登了由麻省理工學(xué)院Hartrampf和Pentelute教授團(tuán)隊(duì)最新成果。他們使用自動(dòng)化化學(xué)平臺(tái)優(yōu)化快速流動(dòng)肽合成（即AFPS，優(yōu)化傳統(tǒng)的固相態(tài)肽合成（SPPS）），并能夠產(chǎn)生完全合成的單結(jié)構(gòu)域蛋白。
它們報(bào)告了高效的化學(xué)反應(yīng)，以及與自動(dòng)快速流動(dòng)儀器相匹配的化學(xué)物質(zhì)，可直接制造長達(dá)327個(gè)連續(xù)反應(yīng)的164個(gè)氨基酸肽鏈。機(jī)器運(yùn)行迅速：數(shù)小時(shí)內(nèi)完成肽鏈的延伸。他們通過化學(xué)合成九種代表酶，結(jié)構(gòu)單位和調(diào)節(jié)因子的不同蛋白質(zhì)鏈來證明該方法的實(shí)用性。純化和折疊后，合成材料顯示出與生物表達(dá)蛋白質(zhì)相當(dāng)?shù)纳镂锢砗兔复傩?。高保真自?dòng)流動(dòng)化學(xué)是生產(chǎn)無核糖體的單域蛋白的替代方法。相關(guān)鏈接發(fā)表在：DOI: 10.1126/science.abb2491
【圖文解析】
1. 快速篩選用于AFPS方案開發(fā)的反應(yīng)變量
這篇文章報(bào)告了一個(gè)常規(guī)方案，該方案允許逐步化學(xué)合成長度超過50個(gè)氨基酸的肽鏈，每個(gè)氨基酸的循環(huán)時(shí)間約為2.5分鐘（圖1（A））。優(yōu)化方案建立在通過AFPS系統(tǒng)獲取的分析數(shù)據(jù)集合的基礎(chǔ)上，可提供高保真度和高手性純度的產(chǎn)品。使用該方案，可以在3.5至6.5小時(shí)內(nèi)合成從芽孢桿菌RNA酶抑制劑（90個(gè)氨基酸）到分選酶A59-206（分選酶A*，164個(gè)氨基酸）的單域蛋白鏈。為了證明功能蛋白的產(chǎn)生，將這些序列折疊，并確定了它們的生物物理特性和酶活性。化學(xué)蛋白質(zhì)合成的時(shí)間尺度與重組表達(dá)的時(shí)6間尺度相等，因此為生物化學(xué)方法提供了一種實(shí)用的替代方法，同時(shí)開辟了超出規(guī)范氨基酸的化學(xué)空間。
作者首先優(yōu)化了常規(guī)參數(shù)，包括流速，反應(yīng)溶劑，試劑濃度，溫度和偶聯(lián)劑（圖1B）。研究了不同活化劑在偶聯(lián)步驟中的性能。還篩選了溫度，時(shí)間和活化劑以及不同的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的影響（圖1C和D）。對(duì)于這兩種氨基酸，差向異構(gòu)體隨激活時(shí)間和溫度而增加。事實(shí)證明，保護(hù)基團(tuán)的選擇對(duì)于組氨酸至關(guān)重要。接著，作者確定了在這些優(yōu)化條件下差向異構(gòu)化作用的數(shù)量不會(huì)在多個(gè)偶聯(lián)循環(huán)中增加（圖1E）。
2. 優(yōu)化的AFPS優(yōu)于傳統(tǒng)的合成方法
作者繼續(xù)調(diào)查了優(yōu)化的AFPS條件是否可以用胰島素原（86個(gè)氨基酸）和人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）蛋白酶（99個(gè)氨基酸）作為測(cè)試序列來促進(jìn)更長序列的合成。使用他們標(biāo)準(zhǔn)的AFPS方案，胰島素原和HIV-1蛋白酶的合成分別在3.5和4.5小時(shí)內(nèi)完成。高效液相色譜(HPLC)純化產(chǎn)生2.2 mg（1％）的純化胰島素原和5.3 mg（1％）的純化HIV-1蛋白酶。在室溫，70°C和90°C的商用合成器上進(jìn)行AFPS和標(biāo)準(zhǔn)一批次的SPPS合成之間的比較表明，優(yōu)化的AFPS方案的合成效果得到了顯著改善（圖2） 。
3. 折疊的合成蛋白結(jié)構(gòu)和功能與重組樣品相當(dāng)
化學(xué)變性可用于評(píng)估合成蛋白的結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性。球狀蛋白芽孢桿菌RNA酶（從解淀粉芽孢桿菌分離自細(xì)菌核糖核酸酶（RNase））是一個(gè)以研究蛋白質(zhì)折疊，變性，并結(jié)合其抑制蛋白芽孢桿菌RNA酶抑制劑模型系統(tǒng)（圖4A ）。通過液相層析串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)和HPLC方法無法區(qū)分合成和重組白芽孢桿菌RNA酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4B ）。使用化學(xué)變性熒光測(cè)定法作為三級(jí)結(jié)構(gòu)完整性的讀數(shù)器（圖4C ）。
HIV-1蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)通過LC-MS和HPLC方法確認(rèn)（圖5B）。HIV-1蛋白酶水解HIV的肽，使用熒光肽可以量化其蛋白水解活性。合成的HIV-1蛋白酶的米氏常數(shù)（MIchaelis constant）為KM = 20.9 ± 1.0 μM，周轉(zhuǎn)數(shù)kcat = 29.6 ± 4.1 s-1，接近于相似文獻(xiàn)中發(fā)表通過SPPS獲得合成樣品的數(shù)值（圖5C）。將合成模型底物肽蛋白酶孵育，可產(chǎn)生類似野生型的在單個(gè)Phe-Pro位點(diǎn)上進(jìn)行獨(dú)有分裂的特異性（圖5D）。
【陳述總結(jié)】
經(jīng)過優(yōu)化的AFPS方案證明了流動(dòng)化學(xué)優(yōu)于常規(guī)一批處理的方法，所產(chǎn)生的肽鏈比常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)SPPS可獲得的肽鏈長三倍以上。通過在可重現(xiàn)的反應(yīng)裝置中快速篩選變量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)現(xiàn)有流程方案的改進(jìn)。自實(shí)施AFPS以來，作者已經(jīng)生產(chǎn)了5000多種肽，并自動(dòng)收集了所有合成的在線分析數(shù)據(jù)。展望未來，可以通過機(jī)器學(xué)習(xí)和其他計(jì)算方法來利用這一廣泛的高質(zhì)量數(shù)據(jù)集來進(jìn)一步改善流程中的肽合成。強(qiáng)大而廣泛使用的常規(guī)化學(xué)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法有望對(duì)化學(xué)生物學(xué)和新療法的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。最后，AFPS具有按需按時(shí)生產(chǎn)的潛力，并可能挽救生命的個(gè)性化藥物，例如用酶替代療法或新抗原的癌癥疫苗。
