王健君:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所 研究員

一百年前科學(xué)家“水變成冰要經(jīng)過(guò)冰核”這個(gè)中間態(tài)的預(yù)言一直不能得到證實(shí),他的團(tuán)隊(duì)攻克了這個(gè)百年的難題,并通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)低溫動(dòng)物的抗凍蛋白控制冰晶生長(zhǎng)的控冰機(jī)制。這一基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題的突破,為食品、航空、醫(yī)療、生物等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)支持。當(dāng)冰凍過(guò)程可控,作為超越人類(lèi)極限的人體凍存技術(shù)或許可以期待。

大家可能知道冷凍保存,因?yàn)槊考颐繎?hù)都有冰箱,冰箱就有冷凍保存的功能。但是大家可能也會(huì)很好奇,為什么這幾年冷凍保存這么受關(guān)注,甚至有爭(zhēng)議?

王健君:實(shí)證百年科學(xué)猜想,人體凍存未來(lái)可期

比如說(shuō)關(guān)于卵母細(xì)胞的凍存,提出了完全不同的議案,有些人支持卵母細(xì)胞的凍存,而另外一些代表則完全反對(duì)卵母細(xì)胞的凍存;

2016年英國(guó)法院判決一個(gè)患有絕癥的14歲女孩的母親勝訴,允許這位母親在其女兒死后將其凍存。這個(gè)判決當(dāng)時(shí)引起了全世界的轟動(dòng),因?yàn)榧词乖诮衲昕茖W(xué)界、法律界還有倫理等方面,對(duì)人體凍存都存在著爭(zhēng)議。

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我們可以看一下冷凍保存的定義,就可以明白為什么凍存這么受關(guān)注,甚至有爭(zhēng)議。

冷凍保存就是將冷凍保存對(duì)象,如細(xì)胞、組織、器官等置于超低溫的環(huán)境當(dāng)中,一般是指在零下196℃的液氮環(huán)境當(dāng)中,使其新陳代謝大大降低,待恢復(fù)正常的生理溫度以后,這些凍存對(duì)象,細(xì)胞、組織、器官能恢復(fù)它正常的生理功能。如果將凍存對(duì)象換成人體,那就意味著幾十年以后,或者幾千年以后,這個(gè)人體如果能復(fù)蘇的話(huà),就能實(shí)現(xiàn)永生了。

這是歷代的帝王、古代埃及的法老一直追求的夢(mèng)想。所以大家可能能明白為什么凍存這幾年這么受關(guān)注,甚至有爭(zhēng)議。

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世界上真正的第一例凍存的人體叫James bedford,他在其死后接受了冷凍保存,距今已經(jīng)有五十三年了。目前世界上總共有受凍存的人體約300例,其中包括兩個(gè)中國(guó)人。

現(xiàn)在我可以很肯定的告訴大家,所有這些凍存的人,由于技術(shù)的原因,他們是不可能復(fù)蘇的。

所以也有科學(xué)家認(rèn)為將人體的冷凍保存是偽科學(xué)。但是美國(guó)的一個(gè)期刊《生活科學(xué)》,它是專(zhuān)門(mén)報(bào)道重大的科學(xué)突破和預(yù)測(cè)未來(lái)研究方向的一個(gè)雜志,它將人體凍存技術(shù)評(píng)為:十大超越人體極限的未來(lái)科學(xué)技術(shù)之一。

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研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境的溫度降低的時(shí)候,能大大增加器官保存時(shí)間。比如說(shuō)目前的器官的保存溫度是在零上4℃,它保存的時(shí)間是幾個(gè)小時(shí),長(zhǎng)的可以達(dá)到二十來(lái)個(gè)小時(shí)。

理論研究發(fā)現(xiàn),如果將器官置于零下140℃的時(shí)候,可以長(zhǎng)期的保持。事實(shí)上,目前有些細(xì)胞,將其置于零下196℃的液氮環(huán)境當(dāng)中的時(shí)候,可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的凍存??墒呛苓z憾的是,目前還沒(méi)有凍存器官的技術(shù)。所以導(dǎo)致保存器官的時(shí)間很短,幾個(gè)小時(shí)、長(zhǎng)的二十來(lái)個(gè)小時(shí),導(dǎo)致了大量的器官被廢棄。

研究數(shù)據(jù)顯示大約70%左右的,或者超過(guò)70%的心肺,由于短時(shí)間內(nèi)不能找到受體而被廢棄,這是非常遺憾的。因?yàn)榧词乖谄鞴僖浦卜浅0l(fā)達(dá)的美國(guó),在七十個(gè)器官衰竭需要移植的人中,只有一個(gè)才能得到器官的移植。

所以在1970年,實(shí)施人類(lèi)肝臟移植手術(shù)的,被稱(chēng)為“器官移植之父”的Thomas Starzl就預(yù)言:“只有當(dāng)保存器官的技術(shù)得到突破,使器官得以保存數(shù)周、甚至數(shù)月的時(shí)候,器官移植才有可能大范圍的推廣?!?/p>

但很遺憾,他這個(gè)說(shuō)法已經(jīng)五十年過(guò)去了,現(xiàn)在的器官保存技術(shù)并沒(méi)有很大的進(jìn)步。

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除了保存器官,冷凍保存還有其他很大范圍的領(lǐng)域,比如說(shuō)能挽救新冠危重患者生命的細(xì)胞療法,當(dāng)然這個(gè)細(xì)胞療法也能治帕金森病,它的大范圍的推廣,必須依賴(lài)于干細(xì)胞的安全的冷凍保存;當(dāng)然另外輔助生殖領(lǐng)域的生殖細(xì)胞的凍存,它的安全性和可靠性,也是非常關(guān)鍵的,因?yàn)檫@涉及到我們的下一代。

大家會(huì)問(wèn),為什么五十年來(lái)凍存技術(shù)沒(méi)有得到突破的進(jìn)展,或者它的關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題是什么呢?

其實(shí)冷凍保存有三要素:第一,當(dāng)然是凍存對(duì)象:細(xì)胞、組織、器官;大家知道器官里面有超過(guò)70%的是水分,將這些水分置于零下的時(shí)候,它必然會(huì)結(jié)冰,所以這就涉及到凍存的第二要素,這些冰如果不控制的話(huà),它必然會(huì)傷害細(xì)胞器官。

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這是一組光學(xué)顯微鏡圖片,可以看到卵母細(xì)胞在冰凍前后受到了冰晶的損害;凍存第三個(gè)要素就是要添加冷凍保護(hù)劑,使器官細(xì)胞內(nèi)避免大冰晶的產(chǎn)生,使器官受到保護(hù),免受冰凍的傷害。

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目前大量使用的凍存保護(hù)劑是一種與鹽相似的,一種跟水能發(fā)生強(qiáng)作用的分子。它的加入可以使器官內(nèi)部在低溫下面不結(jié)冰。但是要使器官內(nèi)將近70%的水分,在零下140℃下面不結(jié)冰,那必須添加大量的這種有毒的鹽。

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有美國(guó)的科學(xué)家理論分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽的重量比達(dá)到50—60%的時(shí)候,器官內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)不結(jié)冰,但是我剛才說(shuō)了,這么高濃度的鹽,必然對(duì)細(xì)胞有損害。

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比如說(shuō)目前普遍使用的凍存劑的一種,也是另外一種鹽的分子,當(dāng)它的濃度超過(guò)2%的時(shí)候,它會(huì)損害細(xì)胞,當(dāng)然嚴(yán)重的時(shí)候,會(huì)改變它的一些基因。

由于這個(gè)原因,所以世界上很多的科學(xué)家都努力嘗試著降低有毒的鹽分子的使用。

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一個(gè)方法就是可以快速地降低溫度,然后升高溫度。在水還沒(méi)反應(yīng)過(guò)來(lái)變成冰之前,已經(jīng)達(dá)到了預(yù)期溫度。但這個(gè)方法對(duì)細(xì)胞是適用的,因?yàn)榧?xì)胞體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,但是對(duì)器官是不適用的,因?yàn)槠鞴袤w積大、復(fù)雜。

這樣快速降溫、升溫的時(shí)候,必然導(dǎo)致有個(gè)溫度梯度的存在,就意味著在器官里面,有些地方溫度高,有些地方溫度低,當(dāng)然都是零下的。相對(duì)比較溫度高的地方,必然會(huì)形成大冰晶損害器官。這也是目前能凍存細(xì)胞,但是不能凍存器官的一個(gè)原因。

大家肯定會(huì)問(wèn),能不能有其他的凍存的方法避免這種有毒的鹽的使用?

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其實(shí)自然界確實(shí)有一些生物,它可以在酷寒下生存。比如說(shuō)生活于沙漠地區(qū)的甲蟲(chóng),叫小胸鱉甲;生活于極地的這種雪虱;還有生活于我國(guó)東北地區(qū)的冬尺蠖;還有阿拉斯加林蛙等等。

我2013年12月去新疆采集這種蟲(chóng)子,叫小胸鱉甲。當(dāng)時(shí)氣溫是零下30℃左右,當(dāng)我們把雪移開(kāi),這個(gè)蟲(chóng)子就跟土壤搭在一塊,就像凍成一塊的。但是很有意思的事情,我把蟲(chóng)子放在我手上幾分鐘以后,蟲(chóng)子能爬起來(lái)。這確實(shí)是非常神奇。

大家可能也會(huì)問(wèn),這些蟲(chóng)子體內(nèi)不可能含有大量的有毒的鹽。如果有的話(huà),它沒(méi)被凍死可能也被毒死了,對(duì)吧?

所以對(duì)自然界控冰體系的、生物體系的研究,必然會(huì)為我們冷凍保存提供新的思路。

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確實(shí)也有很多科學(xué)家研究為什么這些蟲(chóng)子能在低溫下生存?他們發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)子體內(nèi)主要存在的兩類(lèi)蛋白能控制冰晶的形成:一類(lèi)叫抗凍蛋白,它能控制冰晶的生長(zhǎng);另一類(lèi)叫冰晶核蛋白,它能控制冰晶的成核。

我得說(shuō)一下冰晶的形成可以分成兩步:一步是成核,一步是生長(zhǎng)。

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成核最初是一百多年前美國(guó)的科學(xué)家吉布斯提出來(lái)的。他通過(guò)簡(jiǎn)單的宏觀的能量分析,提出冰晶的形成必然會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)形成臨界冰核的階段。如果臨界冰核沒(méi)有形成的話(huà),冰晶不可能生成。

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經(jīng)典成核理論提出已經(jīng)一百多年了,但提出的時(shí)候, 這么多年一直有爭(zhēng)議,有些人支持這個(gè)經(jīng)典成核理論,有些人則反對(duì)經(jīng)典成核理論。

關(guān)鍵就是目前實(shí)驗(yàn)上沒(méi)有探測(cè)到臨界冰核的存在。

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有三個(gè)難點(diǎn):一個(gè)就是臨界冰核尺寸小。尺寸小到什么地步呢?是納米級(jí)別,相當(dāng)于我們頭發(fā)絲的幾萬(wàn)分之一;另外一個(gè)臨界冰核存在的時(shí)間窗口很短,瞬間的,是納秒級(jí)別,非???;另外一個(gè)它是隨機(jī)發(fā)生的,隨機(jī)意味著什么?它不可預(yù)測(cè),沒(méi)有規(guī)律。

由于以上三個(gè)難點(diǎn),世界上最先進(jìn)的儀器,沒(méi)法捕捉到臨界冰核,導(dǎo)致了經(jīng)典成核理論是否適用于冰晶的形成,一直存在著爭(zhēng)議。

我們根據(jù)自然界當(dāng)中存在著兩類(lèi)蛋白,一類(lèi)就是冰晶核蛋白,是目前世界上最好的冰晶成核劑;另一類(lèi)是抗凍蛋白,它沒(méi)有明顯的促進(jìn)冰核形成的效果。更有意思的事情,這兩類(lèi)蛋白唯一的區(qū)別就是尺寸不一樣??箖龅鞍准{米級(jí)別,冰晶核蛋白是幾十納米,兩者差一個(gè)數(shù)量級(jí)。

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為什么尺寸對(duì)冰核的形成如此重要?換句話(huà)說(shuō),是不是可以制備一系列的不同尺寸的這類(lèi)蛋白,讓它去探索這個(gè)臨界冰核,是不是可以把臨界冰核捕捉住?

事實(shí)上,我們通過(guò)生物工程的方法制備了一系列的蛋白,但是遺憾的是,這類(lèi)蛋白大到十幾納米的時(shí)候,機(jī)械性能不好,它會(huì)產(chǎn)生彎曲,所以這種蛋白材料,不可能用來(lái)單變量的研究尺寸的影響,所以我們繼續(xù)找,找到另一種材料叫氧化石墨烯。

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氧化石墨烯就是很薄的一層片層,并且它的機(jī)械性能非常好。我們可以制備一系列尺寸氧化石墨烯。這是氧化石墨烯的電子顯微鏡圖片,可以從3納米、8納米、11納米、21納米、50納米等等。我們就可以用這些納米顆粒去模擬蛋白,去研究尺寸對(duì)冰晶成核的影響。

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確實(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米顆粒的尺寸,與冰晶成核過(guò)冷度的乘積是一個(gè)固定值,并且這個(gè)固定值具有普適性。它對(duì)氧化石墨烯的狀態(tài),無(wú)論是分散在水里面的,還是固定在表面的不同顆粒都適用。

這么一個(gè)普適的物理現(xiàn)象,必然后面有一個(gè)理論機(jī)制。

當(dāng)然我們通過(guò)理論分析發(fā)現(xiàn),其實(shí)氧化石墨烯上臨界冰核的形成過(guò)程,與我們往杯子里面倒水的這個(gè)過(guò)程相類(lèi)似。當(dāng)我們往杯子里面倒水的時(shí)候,水平面與杯沿齊平的時(shí)候,水不會(huì)溢出來(lái)。我們繼續(xù)倒水,水會(huì)鼓出來(lái),這時(shí)候表面張力會(huì)把水包住。繼續(xù)倒水,鼓到一定臨界程度的時(shí)候,水會(huì)忽然溢出來(lái)。

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臨界冰核也是這種情況,它會(huì)在氧化石墨烯上形成,迅速漲到納米顆粒的邊緣。這時(shí)候由于在表面張力作用下,它不會(huì)形成冰晶,只有它繼續(xù)鼓,鼓到一定程度,它會(huì)忽然瞬間的形成冰晶。進(jìn)一步理論分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)氧化石墨烯的顆粒,與臨界冰核的尺寸相當(dāng)?shù)臅r(shí)候,冰晶才有可能形成。

那就意味著,我們可以用納米顆粒,做一把尺子去量臨界冰核,從而我們就證實(shí)了一百多年前吉布斯等人預(yù)測(cè)的臨界冰核的存在。

接下來(lái)我們繼續(xù)講講這個(gè)能控制冰晶生長(zhǎng)的抗凍蛋白的控冰機(jī)制。

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這是2013年我去新疆采集樣品的現(xiàn)場(chǎng)照片,可以看到蟲(chóng)子就在雪和土壤之間。這個(gè)蟲(chóng)子能在酷寒下生存的重要原因之一,就是體內(nèi)存在抗凍蛋白。

抗凍蛋白有兩個(gè)面,就像我們手機(jī)一樣,當(dāng)然尺寸是納米級(jí)別的。

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最初是一個(gè)美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了這種抗凍蛋白,所以很多科學(xué)家研究了抗凍蛋白的抗凍冰機(jī)制。但是五十多年來(lái),關(guān)于抗凍蛋白它是喜歡冰或者不喜歡冰,一直存在爭(zhēng)議。

我是2010年開(kāi)始做這個(gè)研究的。我發(fā)現(xiàn)所有這些研究,它沒(méi)有明確到底哪一個(gè)面喜歡冰,或者哪一個(gè)面不喜歡冰?我就想,我能不能把納米尺度的抗凍蛋白定向固定住,然后選擇性研究抗凍蛋白每一個(gè)面的親冰或者親水性能。

這個(gè)想法當(dāng)然算不錯(cuò)了,示意圖畫(huà)的很簡(jiǎn)單,但實(shí)驗(yàn)操作上是非常困難的。

我的兩個(gè)博士生去做這個(gè)事情,最后有個(gè)叫劉凱的碩博生,克服了兩個(gè)困難,一個(gè)要把是納米級(jí)別的,用手機(jī)定向固定是非常難的;另外一個(gè),我定向固定還不夠,還要維持蛋白的活性,花了可能六年的時(shí)間,他做到了。發(fā)現(xiàn)蛋白有兩個(gè)面,每個(gè)面的親冰、親水不一樣,一面親冰,一面親水。

為什么之前有這個(gè)爭(zhēng)議?相當(dāng)于我們有個(gè)“盲人摸象”的故事一樣。

我們通過(guò)定向固定,選擇性研究抗凍蛋白的性能,解決了這個(gè)爭(zhēng)議。

解決這個(gè)爭(zhēng)議以后,對(duì)我們理解抗凍蛋白的控冰機(jī)制有什么幫助呢?

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大家看一下這個(gè)示意圖:蛋白它一面親冰,可以跟冰很好的結(jié)合;一面親水,可以跟水很好的結(jié)合。這樣就在冰水界面形成很薄的一層蛋白層面,或者分子層面的一堵墻,阻礙了水變成冰,這就是一個(gè)抗凍蛋白的控冰機(jī)制。

通過(guò)我們對(duì)自然界控冰體系的研究,我們可以看出,自然界它不是用簡(jiǎn)單地加大量的鹽去保護(hù)自己,而是通過(guò)控制冰的成核,控制冰的生長(zhǎng)。

我們算有所發(fā)現(xiàn),在有所發(fā)現(xiàn)以后,我們也做到了有所創(chuàng)造,這是我們做材料的一個(gè)特色。

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我們制備了一些能控制冰晶形成的冷凍保護(hù)材料。比如我們目前輔助生殖技術(shù)里面,要用大量的凍存液凍存生殖細(xì)胞,精子、卵子、還有受精卵等等。目前這些凍存液都來(lái)源于外國(guó)進(jìn)口,更嚴(yán)重的是,這些凍存液用的是傳統(tǒng)的方法,含有一些二甲基亞砜,剛才我說(shuō)了它有毒的。用我們的這個(gè)分子凍存卵母細(xì)胞以后,它復(fù)蘇率優(yōu)于目前市場(chǎng)上二甲基亞砜含量15%的,細(xì)胞的復(fù)蘇率遠(yuǎn)優(yōu)于進(jìn)口的二甲基亞砜含量為零的復(fù)蘇率。

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目前我們?cè)跂|莞松山湖材料實(shí)驗(yàn)室的支持下,嚴(yán)格按照國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn),正在生產(chǎn)這些凍存試劑。當(dāng)然我們也研制了一系列能用于干細(xì)胞凍存的凍存液。

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比如我們用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存的材料。用我們這個(gè)材料凍存干細(xì)胞以后,它的復(fù)蘇率達(dá)到了92%,優(yōu)于或者遠(yuǎn)優(yōu)于市場(chǎng)上有毒的二甲基亞砜含量為10%的凍存液。

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目前我們與北醫(yī)三院的眼科合作,我們希望通過(guò)我們創(chuàng)制的一些新的控冰材料,通過(guò)從凍存簡(jiǎn)單的組織器官入手,比如說(shuō)眼角膜的凍存。

希望通過(guò)我們材料的創(chuàng)新,使凍存技術(shù)得到進(jìn)步,當(dāng)然是突破性的進(jìn)步,讓許多醫(yī)療技術(shù)能充分發(fā)揮它們挽救生命的能力。

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這是我的一個(gè)德國(guó)合作者,他2018年去南極捕魚(yú),提取魚(yú)內(nèi)的抗凍蛋白。

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大家知道前段時(shí)間有報(bào)道,我們一般的老百姓可以到空間站去待幾天,當(dāng)然這是距離比較短的。

我們知道宇宙很廣袤,如果想要旅行的話(huà),可能會(huì)花幾十年算少的。我們從地球到那個(gè)地方,如果沒(méi)有采取措施的話(huà),可能生命已經(jīng)結(jié)束了。

我們希望與世界上不同領(lǐng)域的科學(xué)家合作,使冷凍保存助力我們以后的星際旅行。

 

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