3D打印技術(shù)正被運用于實現(xiàn)工業(yè)中的快速原位制造，以及個性化消費產(chǎn)品的生產(chǎn)。如今，先進的3D打印系統(tǒng)已實現(xiàn)將生物材料（主要是水凝膠）、生化試劑和活細胞逐層精確定位到復(fù)雜的3D功能組織中，這使得3D打印技術(shù)邁向了3D生物打印領(lǐng)域。3D生物打印旨在為大范圍的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用復(fù)制生物組織或器官的組成、力學(xué)性能和3D結(jié)構(gòu)。
當前對于臨床應(yīng)用而言，一般是在體外進行構(gòu)件的3D打印，然后通過手術(shù)程序?qū)⑵渲踩塍w內(nèi)。最近報道的原位3D生物打印也僅限于外部的受損區(qū)域，例如皮膚或先前手術(shù)處暴露的部位。
然而，可注射材料用作輸送載體可改善此類局限，有望以微創(chuàng)的方法來提高治療功效，恢復(fù)受損的組織和器官，其中就包括基于干細胞的治療方法?？勺⑸渌z由于具備模仿天然干細胞微環(huán)境的潛力，是干細胞移植的首選材料。但是對3D形狀和空間組織而言，可注射水凝膠在注射部位周圍形成的各向同性的結(jié)構(gòu)無法控制。
意大利帕多瓦大學(xué)Nicola?Elvassore等人研發(fā)出了通過生物正交雙光子環(huán)加成法，在大于850nm的波長下交聯(lián)，可以在活小鼠的組織內(nèi)3D打印的光敏聚合物水凝膠。這種活體內(nèi)的3D生物打印不會產(chǎn)生副產(chǎn)物，并且利用常見的多光子顯微鏡將生物打印結(jié)構(gòu)準確定位和定向到特定的解剖部位，從而可以在活體小鼠組織（包括真皮）中制造復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。
該活體3D生物打印有望成為常規(guī)生物打印的體內(nèi)替代方法，使得直接在活體生物中制造三維結(jié)構(gòu)和功能組織來使器官修復(fù)或重建的微創(chuàng)外科手術(shù)技術(shù)成為可能。該研究以題為“Intravital?three-dimensional?bioprinting”的論文發(fā)表在《Nature?Biomedical?Engineering》上。
【紅外光交聯(lián)策略】
該研究采用了在允許深層組織穿透的激光波長（波長> 800 nm）下使生物聚合物光交聯(lián)到水凝膠中的技術(shù)。由于香豆素介導(dǎo)的環(huán)加成反應(yīng)具有無自由基和光引發(fā)劑的化學(xué)特性，從而避免了對活體組織的潛在毒性。
因此，作者選擇香豆素衍生物作為光敏交聯(lián)部分，用于聚合物主鏈的末端官能化。當香豆素衍生物暴露于單光子紫外可見（UV-Vis）光或在近紅外光的雙光子激發(fā)下時，有可能發(fā)生[2 + 2]環(huán)加成反應(yīng)。
但是UV-Vis波長與組織穿透力不兼容，因此作者采用了紅外光交聯(lián)策略來制備香豆素衍生物用作光敏交聯(lián)部分的水凝膠。作者基于其光吸收性能，選擇了8種香豆素衍生物進行進一步表征（圖2a）。
其中，由于7-羥基香豆素-3-羧酸（HCCA）在7位具有給電子取代基和在3位具有吸電子取代基，被認為是該3D生物打印系統(tǒng)的最優(yōu)選擇。該羧基的存在使HCCA與諸如線性PEG、支鏈PEG和明膠等聚合物共軛（圖2b），從而可用于制造生物相容性良好的水凝膠。
【雙光子水凝膠制備】
作者通過使用與HCCA偶聯(lián)并在寬波長范圍內(nèi)激發(fā)的支鏈PEG和明膠聚合物，測試了組裝3D水凝膠的可能性。之后，通過光交聯(lián)多個z向位置（圖3a）或通過組合添加多個平行的線性物體（圖3b，c），進一步證實了3D光交聯(lián)的準確性。該研究實現(xiàn)了線性物體的最小線寬（1.9±0.2 μm）（圖3b）和生物打印的亞微米分辨率（圖3c）。作者還通過透射電子顯微鏡觀察到HCC-PEG形成納米組裝體，證實了HCC聚合物在水溶液中可以自組裝成超分子結(jié)構(gòu)的設(shè)想。其中HCC光敏基團使它們緊密靠近并準備在光激發(fā)下進行快速環(huán)加成，從而在聚焦的雙光子光學(xué)體系內(nèi)進行有效的交聯(lián)反應(yīng)。這些結(jié)果證明了通過使用HCC聚合物溶液的紅外光介導(dǎo)的光交聯(lián)，能夠制造具有準確3D定位、微米分辨率和可調(diào)節(jié)機械剛度的3D水凝膠。
【體內(nèi)水凝膠生物打印】
皮膚被認為是無需進行額外手術(shù)即可實現(xiàn)3D打印的最佳目標器官。HCC聚合物溶液通過小鼠皮內(nèi)注射的方式實現(xiàn)局部遞送。作者使用雙光子顯微鏡將HCC聚合物溶液暴露于聚焦脈沖近紅外激光（λ= 850 nm）中（圖4a）。然后，作者利用宿主組織的熒光，可以輕松地觀察到真皮內(nèi)部交聯(lián)水凝膠上方的表皮完整性（圖4b），其與未經(jīng)處理的組織相似（圖4b，c）。
此外，作者采用了外科手術(shù)的方式來暴露小鼠完整的骨骼肌，并在其上方注射了HCC聚合物溶液進行光交聯(lián)。結(jié)果表明，在肌纖維表面制造3D水凝膠不會明顯改變總體肌纖維形態(tài)和結(jié)締組織完整性（圖4d，e），且水凝膠僅在進行光反應(yīng)的區(qū)域形成（圖4f）。該實驗裝置能夠在3D生物打印過程中進行實時成像，從而提供了在特定解剖部位觸發(fā)水凝膠交聯(lián)的可行性。這些結(jié)果進一步證實了該3D生物打印系統(tǒng)的高度生物相容性。
總結(jié)：作者證實了3D生物打印可以制造維持細胞功能的水凝膠。這種方法不僅可以預(yù)先在體外進行生物打印，還可以在活體動物不同器官中的組織上進行生物打印，并且能夠做到實時成像。該活體3D生物打印有望成為常規(guī)生物打印的體內(nèi)替代方法，使得直接在活體生物中制造三維結(jié)構(gòu)和功能組織來使器官修復(fù)或重建的微創(chuàng)外科手術(shù)技術(shù)成為可能。
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