淋巴結(jié)（LN）是在臨床治療中許多疾病的治療靶標(biāo)，包括消除B和T細(xì)胞惡性腫瘤。LN定位可增強(qiáng)在包括癌癥和移植在內(nèi)的各種治療環(huán)境的功效。然而，由于淋巴管的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和淋巴結(jié)網(wǎng)狀的大小限制性，很難將貨物運(yùn)送到淋巴結(jié)皮質(zhì)和皮層旁的特定細(xì)胞。淋巴管是抗原呈遞細(xì)胞向局部淋巴結(jié)引流（dLNs）傳遞以介導(dǎo)LN皮層內(nèi)T細(xì)胞啟動的通道?？乖?、細(xì)胞因子和/或病原體載貨間質(zhì)液也通過淋巴管輸送淋巴液出外周組織至邏輯節(jié)點(diǎn)
近日，佐治亞理工學(xué)院生物工程與生物科學(xué)研究所M. G. Finn 和Susan Napier Thomas教授團(tuán)隊(duì)描述了結(jié)合聚硫化丙烯(PPS)的納米顆粒（NP-OND）可克服淋巴和淋巴結(jié)內(nèi)運(yùn)輸障礙的傳遞系統(tǒng)。NP-OND是由納米顆粒（NP）中引入硫醇反應(yīng)性氧雜硼硼烷（OND）接頭，在具有可編程可降解接頭的外圍組織中，它們迅速被輸送至引流淋巴結(jié)。該平臺可控制釋放可移動的淋巴內(nèi)小分子貨物，與單獨(dú)的顆粒或游離化合物相比，其可在整個(gè)淋巴結(jié)中運(yùn)輸至更多免疫細(xì)胞。釋放速率可被編程，允許訪問不同的淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)，從而獲得特定的淋巴細(xì)胞亞群。因此，他們能夠改變藥物性淋巴結(jié)細(xì)胞亞型，以提高免疫治療效果。這項(xiàng)研究成果以題為“Programmable multistage drug delivery to lymph nodes”發(fā)表在期刊《Nature Nanotechnology》。
【圖文解析】
1. 體內(nèi)外多階段NP-OND時(shí)空效應(yīng)
Pluronic F127膠束內(nèi)部的PPS活性陰離子乳液聚合（圖1a–c）產(chǎn)生穩(wěn)定的聚合物NP。這些NP由于具有兩親性質(zhì)，因此非常適合各種分子的綴合，從而為衍生化創(chuàng)建了多個(gè)可交換點(diǎn)。最終的Michael加成反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號可簡便的檢測該步驟（圖1d）。生成的加合物通過retro-Diels–Alder反應(yīng)（圖1a）斷裂，其半衰期不同（圖1e），且OND取代基不同。
NP皮內(nèi)注射后幾分鐘，組織檢查顯示預(yù)期的淋巴管運(yùn)輸?shù)絛LN（圖1f）。它不能選擇性地靶向dLN，僅當(dāng)由NP通過OND連鎖攜帶時(shí)到達(dá)該器官（圖1g，h）。對于具有更長半衰期的OND接頭， dLN中的丹磺酰（Dn）在72小時(shí)內(nèi)熒光顯著增加（圖1i）。作為注射的NP-OND共軛物的一部分，游離Dn的量與OND接頭的半衰期成反比（圖1j）。
2. 增強(qiáng)了向dLN皮質(zhì)細(xì)胞的貨運(yùn)
在LN分區(qū)的粒子和溶質(zhì)是根據(jù)大小來規(guī)定的（圖2a）。這些顆粒被應(yīng)用于膠原水凝膠，其組成類似于LN的膠原結(jié)構(gòu)，作為LN內(nèi)擴(kuò)散的體外模型（圖2b）。在37°C下放置12 小時(shí)后，與連接到半衰期較長的接頭上的若丹明染料（3-Rhod）相比，1-Coum（1-OND）的短片段半衰期可使香豆素染料進(jìn)一步滲透。
NP僅在很小的程度上通過膠原蛋白基質(zhì)遷移（圖2b–d）。在小鼠進(jìn)行皮內(nèi)注射后的一天，整個(gè)dLN中發(fā)現(xiàn)了羅丹明，與保留在外圍的NP相比，羅丹明分布得更深，更集中到組織內(nèi)部（圖2e）。盡管被膜下淋巴竇（SCS）出現(xiàn)NP限制，小分子進(jìn)入LN（副）皮層的能力仍然存在（圖2g），小分子仍能通過流式細(xì)胞術(shù)測量釋放的細(xì)胞攝取染料。在30–40 ％的LN駐留細(xì)胞，Rhod-F（一種小分子染料）從NP大量釋放（圖2h）。
總體而言，通過基于NP的兩階段方法，靶向細(xì)胞的數(shù)量提高了幾個(gè)數(shù)量級。T細(xì)胞從數(shù)百種增加到數(shù)萬種，B細(xì)胞從幾千到數(shù)十萬。兩種常見細(xì)胞（cDCs）從數(shù)百到數(shù)千（圖3a，b）。這些改善LN內(nèi)的相應(yīng)細(xì)胞亞型的10％，60％和50％（圖3c）。除了增加靶向細(xì)胞的頻率外，從NP釋放還導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞向B細(xì)胞以及向漿細(xì)胞（pDC）的總貨運(yùn)量增加（圖3d）。這些結(jié)果可以歸因于這些細(xì)胞的不對稱LN分布，導(dǎo)致輸入的淋巴種類可及性有所不同。
3. 設(shè)計(jì)釋放載物的速率
通過對Pluronic電暈的化學(xué)修飾，作者設(shè)計(jì)了基于OND附著來改變載物從PPS NPs釋放特性（圖4a）。與3-Rhod或4-Rhod結(jié)合后，通過透析評估呋喃衍生化分子的釋放速率（圖4b）。如同帶有內(nèi)部附著貨物的顆粒一樣，皮內(nèi)dLN駐留細(xì)胞的攝取受接頭裂解率控制，在每種情況下，其峰值約為接頭斷裂半衰期的兩倍（圖4c）。對于距LN SCS更遠(yuǎn)的細(xì)胞（例如，T細(xì)胞與B細(xì)胞，圖4d），遞送程度也隨時(shí)間增加。
4. 增強(qiáng)免疫治療劑的生物活性
為了探索使用這種化學(xué)方法來增強(qiáng)免疫治療劑的生物活性，作者還采用了巰基封端的CpG寡核苷酸作為Toll樣的受體9（TLR9）配體，這些細(xì)胞以及T細(xì)胞的總數(shù)（圖5a）和每種亞型（圖5b–d）至少增加了三倍。與僅使用媒介物和僅使用CpG的對照相比，該藥物不會引起額外的激活或增殖（圖5a–d）。因此，低劑量（0.05 mg kg-1）下的活性都需要NP運(yùn)輸?shù)絃N和細(xì)胞外淋巴間隙中定時(shí)釋放。實(shí)際上，在同一只動物中，NP-OND-CpG處理的患病LN不大于未患病的nLN（圖5e，f），并且通過免疫組織化學(xué)觀察到LN腫瘤負(fù)荷幾乎完全消失。這些結(jié)果表明該模型中淋巴瘤基本被消除并且被進(jìn)一步預(yù)防。該治療還減小了原發(fā)腫瘤。
【結(jié)論】
作者在這里展示了由免疫系統(tǒng)處理顆?？乖姆绞剿鶈l(fā)的兩階段方法的發(fā)展。首先，抗原顆粒被淋巴管有效轉(zhuǎn)移到dLNs，而沒有明顯的全身性暴露。其次，OND-硫醇化用于將小分子貨物附著到這些顆粒上，并以可編程的方式釋放，以便在進(jìn)入淋巴液后被動擴(kuò)散。
有了這個(gè)系統(tǒng)，作者實(shí)現(xiàn)了對dLN內(nèi)細(xì)胞的總遞送量的數(shù)量級改善，從而大大增加了對通常難以接近的淋巴細(xì)胞亞群的遞送。
此外，可以通過使用不同片段半衰期的接頭來控制該遞送的時(shí)間。同時(shí)，實(shí)用的兩階段系統(tǒng)代表了一種前所未有的方式來調(diào)整這種生理結(jié)構(gòu)，以便在給藥后的所需時(shí)間達(dá)到目前難以接近的cDC、T細(xì)胞和癌細(xì)胞，從而改善治療效果。在減輕LN腫瘤負(fù)擔(dān)方面已初步證明了這種結(jié)果。多階段遞送的概念，無論是具體的還是廣泛的，都類似于在針對腫瘤的藥物靶向領(lǐng)域中長期探索的策略，但是現(xiàn)今在免疫工程和免疫療法中并未得到充分利用。
