多糖是一類像核酸蛋白質(zhì)的生物大分子,在生命過程中發(fā)揮著重要的作用。由于多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且存在微觀不均一性,其合成又沒有像核酸和蛋白質(zhì)那樣有固定的模板可以遵循,因此多糖的合成問題長期困擾著合成化學(xué)家。

阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan)是一種重要的多糖,它是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的重要組成成分,與細(xì)菌的存活力和致病力相關(guān)。該分子由一條半乳聚糖鏈(A鏈)和兩條緊密靠近的阿拉伯聚糖鏈(B鏈)所組成(圖1),具有高度分支的結(jié)構(gòu),其化學(xué)合成不僅為結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁生物合成機(jī)制的闡釋提供基礎(chǔ),而且有助于開發(fā)預(yù)防結(jié)核病的新型糖疫苗。正因?yàn)槿绱?,該多糖分子近二十年來一直吸引著國?nèi)外糖化學(xué)研究小組的興趣;然而該分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其人工合成存在巨大的挑戰(zhàn)性。

《Nature》譽(yù)為“糖之父”的Seeberger打破世界紀(jì)錄,史上最長人工合成多糖!
圖1.阿拉伯半乳聚糖的結(jié)構(gòu)示意圖

2017年,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部葉新山課題組從簡單的單糖原料出發(fā),采用他們前期所發(fā)展的基于糖基供體“預(yù)活化”的一釜寡糖合成策略(Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 5221),以克級規(guī)模實(shí)現(xiàn)了寡糖鏈的大量制備;并且利用構(gòu)象受限的糖基供體高立體選擇性地構(gòu)建1,2-順式糖苷鍵;隨后再次使用“預(yù)活化”一釜寡糖合成策略分別完成了兩條多糖鏈(A鏈和B鏈)的快速組裝;最后采用他們自己發(fā)展的糖基化反應(yīng)偶聯(lián)劑(Synlett,2006, 2846),經(jīng)[31+31+30]糖基化反應(yīng)將兩條B鏈與A鏈定點(diǎn)對接,順利實(shí)現(xiàn)了高度分支化、由92個(gè)單糖單元所組成的阿拉伯半乳聚糖的首次全合成。

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最近,受到自動(dòng)合成多核苷酸和多肽的啟發(fā),德國馬普研究所的Peter H. Seeberger教授課題組在自動(dòng)多糖合成裝置(AGA)中,通過201個(gè)步驟,僅用188小時(shí)就合成出了100個(gè)鏈段長度的多糖碳水化合物,一舉打破了之前92的記錄,收率為5%。他們還將合成的30和31個(gè)鏈段長度的寡糖[31 + 30 + 30 + 30 + 30]通過偶聯(lián)反應(yīng)制備出151個(gè)鏈段長度的枝鏈聚甘露糖苷,收率41%。這一研究提出了一種快速合成結(jié)構(gòu)確定的長鏈多糖化合物的方法,必將有利促進(jìn)生物和材料科學(xué)的發(fā)展。

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100個(gè)鏈段長度的直鏈多糖的合成

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圖1. 直鏈多糖的自動(dòng)合成過程。(A)概念:每個(gè)過程由4步組成:酸洗、糖基化、保護(hù)未反應(yīng)的親核基團(tuán)、脫保護(hù)以進(jìn)行下一個(gè)循環(huán);(B)自動(dòng)合成100個(gè)鏈段的α-(1-6)-多甘露糖苷4。

為了合成100個(gè)鏈段長度的直鏈多糖化合物,研究者在AGA中加入含有光裂解基團(tuán)的聚苯乙烯Merrifield樹脂和19 μmol的甘露糖2進(jìn)行反應(yīng),每個(gè)過程由4步組成:①酸洗20分鐘,以去除殘留的堿;②糖基化反應(yīng)20-60分鐘,甘露糖為5-6.5當(dāng)量;③保護(hù)未反應(yīng)的親核基團(tuán)30分鐘;④脫除Fmoc碳酸酯保護(hù)基團(tuán)14分鐘,以進(jìn)行下一個(gè)糖基化反應(yīng)。上述4個(gè)步驟重復(fù)進(jìn)行就能不斷增加多糖的鏈長。

隨著多糖鏈長的不斷增加,糖基化反應(yīng)時(shí)間隨之增加,鏈長為40時(shí),時(shí)間從20分鐘增加到40分鐘,超過80后,糖基化時(shí)間延長到60分鐘,經(jīng)過188小時(shí)后多糖鏈段增長到100。最初加入了9 g甘露糖2,最終得到了39 mg 的α-(1-6)-聚甘露糖苷3,收率為5%。通過自動(dòng)合成方法,研究者合成了最長鏈段的多糖化合物,大大降低了合成時(shí)間。

151個(gè)鏈段長度的枝鏈多糖的合成

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圖2. 從30個(gè)和31個(gè)鏈段長度的聚甘露糖苷(7、8和10)偶聯(lián)合成151個(gè)鏈段長度的支鏈聚甘露糖苷12。(A)利用AGA合成30鏈段長度的聚甘露糖苷7和8;(B)合成31個(gè)鏈段長度的聚甘露糖苷10;(C)8和10偶聯(lián)反應(yīng)得到11。

為了制備出枝狀結(jié)構(gòu)的多糖,研究者以樹脂5為載體,甘露糖2為原料,經(jīng)過45小時(shí)合成了線性α-(1-6)- 聚甘露糖苷6,在光解、三氯乙腈或脫氧氟處理后得到了化合物7和8。隨后研究者以甘露糖2和分支結(jié)構(gòu)9合成了31個(gè)鏈段長度的聚甘露糖苷10。

他們以三氟甲磺酸銀-茂鐵二氯化物為活化劑,以6當(dāng)量的化合物8和10合成了151個(gè)鏈段長度的枝狀多糖11,收率為78%,同時(shí)還產(chǎn)生了20%的121個(gè)鏈段長度的副產(chǎn)物。

在化合物11中加入甲醇鈉處理16小時(shí),以去除148個(gè)酯基保護(hù)基體,然后通入氫氣,以鈀/碳為催化劑,氫化72小時(shí)去除302個(gè)芐基醚和1個(gè)Cbz保護(hù)基團(tuán),最終得到了完全脫保護(hù)的化合物12,收率41%,通過1H、13C NMR以及MALDI-mass分析確定了支鏈12是迄今為止人工合成的最長枝鏈多糖。

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小結(jié)

德國馬普研究所的Peter H. Seeberger教授課題組在AGA中以PS樹脂為載體、甘露糖2為原料,僅耗時(shí)188小時(shí)就合成了100個(gè)鏈段長度的聚甘露糖苷化合物,收率5%,一舉打破了92個(gè)鏈段長度的記錄。

每個(gè)過程包括酸洗、糖基化、保護(hù)和脫保護(hù)四個(gè)步驟,重復(fù)這個(gè)過程就能不斷增加多糖的鏈長,隨著多糖鏈長的不斷增加,糖基化反應(yīng)時(shí)間隨之增加,鏈長超過80后,糖基化時(shí)間提高到60分鐘。他們還以鏈長30的直鏈聚甘露糖苷7和8,鏈長31的枝鏈聚甘露糖苷10為原料合成了151個(gè)鏈段長度的枝狀多糖11,在脫除了148個(gè)酯基、302個(gè)芐基醚和1個(gè)Cbz保護(hù)基團(tuán)后,得到了迄今為止最長的枝鏈多糖化合物,收率41%。

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