光動(dòng)力療法(PDT)是一種臨床策略,其原理是利用光敏劑(PS)化合物在氧氣(O2)存在下暴露于特定波長(zhǎng)的光,然后產(chǎn)生細(xì)胞毒性自由基和活性氧物種(ROS),如單線態(tài)氧,從而治療淺表性或局限性腫瘤及其他疾病。具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)特性的PS藥物的發(fā)展使PDT的新策略得以實(shí)現(xiàn)。AIE基熒光團(tuán)以孤立分子的形式存在于溶液中時(shí),其發(fā)射率最小,而當(dāng)它們以聚集體的形式存在時(shí),則會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的發(fā)射。AIE發(fā)光劑(AIEgens)是生物成像應(yīng)用的理想工具,因?yàn)樗鼈兙哂懈叨鹊墓夥€(wěn)定性、生物相容性,而且可以實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度成像。重要的是,許多AIEgens可以很容易地產(chǎn)生ROS并用于基于PDT的治療干預(yù)。不幸的是,大多數(shù)AIE-PS化合物是非常疏水的,因此不能很容易地用于體內(nèi)生物環(huán)境中。之前的基于AIEgen系統(tǒng)的載藥量(DLC)低、包封效率(EE)低、對(duì)特定腫瘤的能力有限、組織滲透能力差,因此,開(kāi)發(fā)新的基于AIEgen的平臺(tái)作為一種更有效地滲透腫瘤的手段是非常必要的。除上述局限性外,實(shí)體瘤中常見(jiàn)的缺氧腫瘤微環(huán)境(TME)由于缺乏O2而影響PDT的療效,而O2是這些治療策略有效性的關(guān)鍵。

腫瘤胞吐小體(exosomes,EXO)是增強(qiáng)AIE-PS腫瘤滲透和療效的一種潛在的理想途徑。EXO是一種小顆粒(50-200納米),由細(xì)胞分泌,來(lái)源于多泡體。EXO具有許多特性,包括缺乏免疫原性、良好的生物相容性、以及由于內(nèi)源性來(lái)源而長(zhǎng)時(shí)間保持循環(huán)的能力,使其成為很有希望的藥物傳遞的候選方法。還能夠穿過(guò)血腦屏障并深入到結(jié)構(gòu)或其他致密組織類型中。重要的是,EXO可以被細(xì)胞內(nèi)化,并且可以以基于EXO膜和細(xì)胞表面特異性蛋白質(zhì)譜的特定方式歸屬于特定的組織或細(xì)胞類型。EXO不僅可以增加不溶于水的化合物的溶解度,而且也非常適合臨床藥物傳遞應(yīng)用,因此,EXO/AIEgen雜化納米囊泡具有很大的潛力實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥有效的PDT治療。

最近,香港科技大學(xué)的唐本忠院士在《Angewandte Chemie International Edition》上發(fā)表了題為“Tumor-exocytosed exosome/AIEgen hybrid nano-vesicles facilitate efficient tumor penetration and photodynamic therapy”的文章,采用電穿孔法制備了腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡(DES),該囊泡有助于腫瘤的高效滲透。然后使用地塞米松使TME內(nèi)的血管功能正?;?,以減少局部缺氧,從而顯著增強(qiáng)DES納米囊泡的PDT效果,使其能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)。他們首次實(shí)現(xiàn)了AIEgen與生物腫瘤胞吐小體的雜化,并將PDT方法與腫瘤內(nèi)血管正?;嘟Y(jié)合,作為減少局部組織缺氧的手段。

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進(jìn)腫瘤滲透和光動(dòng)力治療

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進(jìn)腫瘤滲透和光動(dòng)力治療
腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡促進(jìn)腫瘤有效滲透和光動(dòng)力治療的示意圖

 

圖文導(dǎo)讀

1. DES的制備和表征

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡(DES)采用電穿孔法制備,其中AIEgen采用先前研究的DCPy(B. Z.?Tang,?ACS Nano?2018, 12, 8145-8159)。用膜熒光探針DiO對(duì)其進(jìn)行了染色,可以在共焦顯微鏡下觀察到亮綠色的DiO熒光和紅色的DCPy熒光(圖1C),證實(shí)了DCPy在這些DES中的成功偶聯(lián)。此外DES納米囊泡的紫外可見(jiàn)吸收光譜在452nm處呈現(xiàn)出DCPy的吸收峰特征(圖1D)。根據(jù)DCPy電穿孔效率值,隨著初始DCPy濃度的增加,包覆效率緩慢上升,直至達(dá)到88.2%的最大值,比常用的聚合物納米粒子高很多。在4℃的PBS中儲(chǔ)存3天后,DES納米囊泡大小和zeta電位無(wú)明顯變化,表明這些顆粒高度穩(wěn)定(圖1F和1G)。光致發(fā)光(PL)光譜分析表明,DCPy的AIE性質(zhì)和DCPy的PL性質(zhì)在DES形成后發(fā)生了藍(lán)移,再次表明了雜化納米囊泡的成功制備。

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圖1(A)EXO和(B)DES納米囊泡的TEM圖像。(C)用共焦顯微鏡觀察DES納米囊泡內(nèi)DiO(綠色)和DCPy(紅色)的共定位。(D)PBS中DCPy、EXO和DES納米囊泡的紫外可見(jiàn)光譜,插圖顯示DCPy(DMSO中)、EXO(PBS中)和DES納米囊泡(PBS中)的顏色。(E)EXO、DCPy和DES納米囊泡的Zeta電位值。(F)用DLS法測(cè)量了EXO和DES納米囊泡的水動(dòng)力直徑。(G)分別于第1、2、3天測(cè)定懸浮于PBS中的DES納米囊泡的zeta電位。(H)含10%DMSO、100%DMSO和DES-PBS溶液的DCPy聚合懸浮液的PL光譜。插圖:在365納米紫外線照射下拍攝的DCPy熒光照片。(I)Western blotting檢測(cè)CD9(i)和CD63(ii)等外顯子標(biāo)記。

2.?體外試驗(yàn)

DES體外靶向癌細(xì)胞試驗(yàn)。由于DES納米囊泡是由腫瘤細(xì)胞制備的,因此它們很容易被靶腫瘤細(xì)胞內(nèi)化。DCPy在體內(nèi)化后能夠特異性地染色活細(xì)胞中的線粒體,因此這種內(nèi)化很容易被追蹤。他們將4T1細(xì)胞與DES納米囊泡一起孵育,并使用商業(yè)線粒體Mito-tracker Green FM探針進(jìn)行染色(圖2A和2E)。30分鐘潛伏期后,可見(jiàn)DES納米囊泡附著在4T1細(xì)胞上,2小時(shí)后,DES納米囊泡內(nèi)的DCPy染色可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞線粒體。這些結(jié)果證實(shí)DES是靶向腫瘤細(xì)胞和線粒體的理想平臺(tái)。

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圖2(A)隨著時(shí)間的推移,4T1腫瘤細(xì)胞中Mito-tracker Green FM探針(綠色)和DCPy(紅色)或DES的共定位。(B)在正常或缺氧條件下,PBS、DCPy或DES治療和隨后532nm激光照射(0.5W/cm2,5min)后的相對(duì)腫瘤細(xì)胞存活率,通過(guò)MTT分析進(jìn)行評(píng)估。(C)治療后腫瘤細(xì)胞熒光圖像和(D)DCFH-A熒光強(qiáng)度。(E)用ImageJ軟件對(duì)A的DCPy熒光強(qiáng)度進(jìn)行了定量分析

DES顆粒體外PDT療效及生物相容性評(píng)價(jià)。這些AIEgen和DES的有效1O2生成對(duì)于PDT療效十分重要。因此,他們使用ABDA評(píng)估了它們產(chǎn)生1O2的能力,后者可能會(huì)被1O2氧化生成內(nèi)過(guò)氧化物,從而導(dǎo)致ABDA吸收減少。在0.5W / cm2的照射劑量下,DCPy和DES存在下的ABDA吸收量急劇下降。而且,即使在高濃度的DCPy下,它們也具有令人滿意的生物相容性。然后在正常和缺氧條件下評(píng)估DES納米囊泡的PDT療效(圖2B)。在常氧條件下,DES或DCPy處理對(duì)適當(dāng)?shù)募す庹丈溆酗@著的光毒性。然而,在缺氧條件下,這種效果明顯降低。當(dāng)使用DCFH-DA探針定量這些細(xì)胞中的活性氧產(chǎn)生時(shí),正常條件下的熒光強(qiáng)度比缺氧條件下的明顯降低(圖2C)。證實(shí)氧水平可以深刻地影響DES或DCPy介導(dǎo)的抗腫瘤PDT治療方案的療效。

為了克服這一局限性,利用地塞米松(DEX)作為T(mén)ME調(diào)節(jié)劑,作為改善這些腫瘤內(nèi)有效氧供應(yīng)的一種手段。為了證實(shí)該方法的有效性,從腫瘤植入后11-14天起,每天用DEX(3mg/kg)或PBS(n=3/組)皮下注射帶有4T1腫瘤的BALB/c小鼠一次。結(jié)果表明,與PBS治療相比,DEX治療明顯降低了低氧誘導(dǎo)因子HIF-1的染色強(qiáng)度,證實(shí)該治療干預(yù)措施足以明顯緩解腫瘤內(nèi)缺氧。

3.?體內(nèi)試驗(yàn)

DES的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、生物分布及腫瘤組織滲透性評(píng)價(jià)。除了具有高度的細(xì)胞毒性和易于被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化外,理想的抗腫瘤平臺(tái)還需要具有良好的系統(tǒng)生物分布特征。為了突出DES在體內(nèi)的生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)特性,他們使用聚乳酸-乙醇酸(PLGA)來(lái)包埋DCPy,并成功制備了PLGA/DCPy雜化納米粒子(DPS),與DES進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)觀察4T1荷瘤小鼠(n=3/組)體內(nèi)DES和DPS的分布發(fā)現(xiàn),DES和DPS在肝臟內(nèi)的積聚相對(duì)較強(qiáng),并且DES在動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出比DPS更有效的腫瘤傾向性(圖3D)。值得注意的是,在DES介導(dǎo)的治療(圖3E和3F)后,從血管中可檢測(cè)到約200μm的DCPy熒光,表明DES納米囊泡可以很容易地從血管中滲出,從而在有或無(wú)DEX的情況下深入腫瘤組織。

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進(jìn)腫瘤滲透和光動(dòng)力治療
圖3(A)PBS和DEX治療后的典型CD31(紅色)和αSMA(綠色)免疫熒光圖像。(B)PBS和DEX治療后具有代表性的HIF-1α免疫熒光圖像。(C)4T1荷瘤小鼠注射后48h主要臟器的活體熒光顯像和顯像。白色虛線表示腫瘤。(D)DCPy+DEX、DES納米囊泡、DPS+DEX或DES+DEX等劑量(5mg/kg)注射后12h DCPy組織生物分布的定量研究。(E)在4T1荷瘤小鼠治療后12h的腫瘤組織切片中,DCPy(紅色)與CD31標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞(綠色)共定位。(F)DCPy在血管和腫瘤組織中的分布特征。

DES體內(nèi)PDT療效評(píng)價(jià)。他們將4T1乳腺癌小鼠隨機(jī)分為6個(gè)治療組:1)對(duì)照組(PBS);2)激光(L,532nm激光照射,0.5W/cm2,20分鐘,4個(gè)照射點(diǎn),每個(gè)照射點(diǎn)5分鐘);3)DEX;4)DES;5)DES+L;和6)DES+DEX+L組(圖4A)。DES給藥與激光照射的結(jié)合介導(dǎo)了腫瘤生長(zhǎng)的部分抑制,而當(dāng)動(dòng)物也用DEX治療時(shí),這種抑制作用更為有效(圖4B、4C)。蘇木精和伊紅(H&E)染色的組織切片進(jìn)一步證實(shí),DES+DEX+L治療與大量壞死或凋亡腫瘤細(xì)胞死亡(圖4D)同時(shí)出現(xiàn)的顯著腫瘤組織丟失有關(guān)。用DCFH-DA測(cè)定這些治療小鼠的腫瘤內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生,顯示DES+DEX+L聯(lián)合治療小鼠的腫瘤染色明顯增強(qiáng)。這證實(shí)了在這些動(dòng)物身上觀察到的增強(qiáng)療效與自由基生成改善有關(guān)。

腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡,促進(jìn)腫瘤滲透和光動(dòng)力治療
圖4(A) DEX+DES+L實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)綜述。(B)腫瘤體積隨時(shí)間的變化(C)治療后的平均腫瘤重量值。(D) 指定治療組的H&E染色腫瘤切片,并通過(guò)DCFH-DA染色測(cè)量腫瘤切片中的活性氧。

亮點(diǎn)小結(jié)

綜上所述,作者開(kāi)發(fā)了腫瘤胞吐小體/AIEgen雜化納米囊泡。這些DES納米囊泡在體內(nèi)很容易穿透腫瘤,當(dāng)與DEX聯(lián)合使用時(shí),作為缺氧TME血管正常化的一種手段,是PDT應(yīng)用的理想選擇。首先,這種納米系統(tǒng)克服了在PDT中使用AIEgens的許多限制。此外,將這些仿生納米囊泡與DEX介導(dǎo)的腫瘤血管正常化治療結(jié)合起來(lái),作為增強(qiáng)激光照射后腫瘤內(nèi)ROS生成的手段,從而提高PDT的性能??傊?,這項(xiàng)工作強(qiáng)調(diào)了一種新的腫瘤PDT方法,并強(qiáng)調(diào)了AIEgens的潛在臨床應(yīng)用。

全文鏈接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202003672

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